重组腺病毒-慢病毒构建包装服务

为促进国内相关领域的研究进展,上海闪晶分子生物有限公司从2008年开始,对国内实验室开展重组腺病毒/慢病毒构建、包装及扩增服务,可以由客户提供自己的基因,完成腺病毒/慢病毒构建、鉴定、包装的服务。我们的宗旨是:“专业公司,打造专业服务!”

一、技术路线

(一)A腺病毒载体构建

本系统是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA为骨架,在克隆、包装、扩增等各部条件做了改进和优化,达到了克隆阳性率更高、质量更可靠、包装稳定、出毒迅速、滴度高等效果。在此基础上,还拓展了更广泛的应用,可以提供各种带报告基因的,带不同标签的腺病毒构建和包装服务。所包装的腺病毒已成功应用于信号转导,基因转位,Co-IP,动物实验,干细胞研究等科研实验。并且可以完成较高难度的克隆构建,包括具有细胞毒性作用基因的腺病毒构建,在短时间内完成从原始质粒到病毒DNA的构建工作。 

  • 克隆目的基因到穿梭载体(中介载体)及鉴定

根据客户提供的原始质粒信息确定克隆方案:

    • 如果原始质粒与本系统所用穿梭载体有匹配酶切位点,采用相应的内切酶切下相应片断,回收并连接到穿梭载体。酶切,测序鉴定;
    • 如果原始质粒与本系统所用穿梭载体没有匹配酶切位点,设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增,得到目的片断,采用相应的内切酶切下相应片断,回收并连接到穿梭载体。酶切,测序鉴定;
    • 对于不适用于以上方案或者有特定要求的样品,与客户协商定制具体实施方案

2)克隆目的基因到腺病毒载体pAdPL及鉴定

利用重组技术将目的片段的表达框从穿梭载体转移到腺病毒载体。

酶切鉴定阳性克隆,将阳性克隆测序二次鉴定。

B慢病毒载体构建

慢病毒(Lent virus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体,该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,达到持久性表达的效果。可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景。

(二)病毒包装、扩增:

  • 将鉴定正确的基因克隆到慢病毒载体,与辅助载体一起转染293T细胞进行包装;
  • 将包装好的病毒超速离心收集;
  • 将浓缩病毒进行滴定,滴定结果单位为PFU/ml(一般为5×108 PFU/ml以上,体积为500μl以上,根据客户需要,不同量有价格差异)

二、质量控制与鉴定

  • 测序鉴定
  • 根据特定引物作RT-PCR鉴定
  • 蛋白表达鉴定(根据客户要求并由客户提供高特异性抗体)

三、客户须知:

对于客户所要构建腺病毒的目的基因,客户须提供详细的基因相关信息,包括基因序列,载体序列,载体图谱。

载体构建步骤所需时间,根据不同构建方案,需15到25个工作日。

从合同签订之日起,客户需交纳首期技术服务费(50%服务费),方可进行实验。服务结束时一次结清余款。

客户需提供的信息及材料:

  • 插入目的片段序列信息,原始载体序列信息,载体图谱,酶切分析图等。
  • 鉴定正确的原始质粒,PCR引物及PCR鉴定方法说明(包括PCR体系及PCR条件)(非必需,或需协商),测序引物(非必需,或需协商)。
  • 原始质粒的酶切鉴定报告、测序报告,如果客户确定基因的信息无误,这条非必需。
  • 实验目的、要求,目的基因有无细胞毒性,是否需要构建对照病毒?
  • 实验要求包括:是否自行构建腺病毒载体?是否要求更换启动子、polyA等基因元件?
  • 实验目的包括:用于细胞实验还是动物实验,需要感染的细胞类型或动物模型类型。

四、我们的承诺:

  • 构建腺病毒/慢病毒载体的时间约15到25个工作日。病毒的包装,扩增的时间约20到30个工作日。总计需要45-55个工作日。
  • 提供重组穿梭载体或者siRNA载体,重组腺病毒载体的酶切及测序报告。
  • 免费提供一管阴性对照(仅限通用型的,如果客户指定的序列,需要另外计费)。
  • 最大插入片段5kb-8Kb。

补充说明:

  • 如果客户需更换启动子,需保证所插入的基因的表达产物对细胞无毒害作用,
  • 如果插入的目的片段太长,客户要求测序验证全长,需要提供基因的特异引物,以测得全长,加收一定的费用。

五、腺病毒包装慢病毒包装比较表 

腺病毒载体系统和慢病毒载体系统比较

病毒表达系统

腺病毒表达系统(Adenovirus)

慢病毒表达系统(Lentivirus)

病毒基因组

双链DNA病毒

RNA病毒

复制

自主复制

自主复制

是否整合

病毒基因组游离于宿主基因组外,瞬时表达外源基因

病毒基因组整合于宿主基因组,长时间、稳定表达外源基因

感染细胞类型

感染分裂和不分裂细胞

感染分裂和不分裂细胞,适合难转染的原代细胞(如神经细胞,淋巴细胞)及体内实验

表达丰度

高水平表达

中水平表达

表达时间

快(1-2 天)

慢 (  1-3天 )

滴度

滴度高达1011pfu/ml

滴度最高可达108 pfU/ml

克隆容量

可插入高达8kb的外源片段,滴度随插入片段长度增加而降低

可插入不超过8kb的外源片段,滴度随插入片段长度增加而降低

免疫原性

高免疫原性

低免疫原性

联系电话:021-54460832 Email:master@shinegene.org.cn QQ:896197990
细胞培养

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
版权所有 ©2004
上海闪晶分子生物科技有限公司(上海闪晶分子生物技术研究所)
地址:上海市闵行区北桥镇吴河路328号A栋2楼 邮编:201109 电话/传真:021-54460831