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DNA测序原理

DNA测序技术主要依据 Sanger 的双脱氧链终止法。以DNA单链为模板,在特定条件下,用特异的引物在测序级DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则,不断将 4 种脱氧核糖核苷酸 (dNTP) 加到引物的 3'- 羟基末端并使引物链得到延伸。这种链的延伸是通过引物的 3'- 羟基和脱氧核糖核苷酸底物的 5'- 磷酸基团形成磷酸二酯键来完成的。如果这种反应体系中加入双脱氧核糖核苷酸 (ddNTP) ,这种 2'3'ddNTP 的 5'- 磷酸基团是正常的 (4 种不同的荧光标记 ) ,而 3' 位置缺少羟基,因此在 DNA 聚合酶作用下,仍然可以通过 5'- 磷酸基团与引物链的 3'- 羟基反应掺入到引物链中,但是由于 ddNTP 没有 3'- 羟基,不能继续与下一个 5'- 磷酸基团形成磷酸二酯键而导致引物链延伸的终止。这样,在测序反应体系中, DNA 引物链不断合成与偶然终止,产生一系列的长短不等的核苷酸链,然后将这些反应产物进行电泳,即可得测序图谱。

样品要求

样品类型

相应要求

 

 

菌体

1. 说明载体抗性类型,我们提供 Amp, Kan, Tet 及 Chl 四种抗生素。
2.   提供 1ml 左右过夜培养的菌液,加 15% 灭菌甘油,于 Eppendorf 管中封口保存,防止交叉污染或渗漏。
3.   大量样品测序,建议在一次性塑料培养皿固体培养基上穿刺培养。
4.   建议尽量提供穿刺培养的菌种。

 

质粒

1. 质粒溶于适量体积双蒸水中(不含 TE ),电泳检测总量大于 2mg 。

2. 建议用相关试剂盒纯化。
3. 如有可能,同时提供 1ml 含有相应质粒的菌液备用。
4. 大质粒必需注明载体长度。

 

未纯化 PCR 产物

1. 片段大于 150bp 。
2. 提供 50ul ~ 100ul PCR 扩增产物 ( 总量 500ng-1ug) 。
3. 取 3ul 样品,电泳检测应为明亮的一条带,无杂带。

 

纯化 PCR 产物

1.PCR 产物溶于双蒸水中(不含 TE )。

2. 浓度大于 20ng/ul ,体积大于 20ul ,长片段需适当增加量。
3. 电泳检测条带专一。

自备的引物

1. 浓度不低于 5pmole/ul( 或 5umol/L) ,体积大于 20ul 。
2. 随机引物和简并引物不能用于测序。
3. 尽可能提供引物全序列、 PCR 退火温度,以供参考。

测序结果常见的几个问题

1 、 为什么开始一段序列的信号很杂乱,几乎难以辨别?
这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致,该干扰峰和正常序列峰重叠在一起;另外,测序电泳开始阶段电压有一个稳定期,所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚,有时甚至更长。

2 、 为什么在序列的末端容易产生 N 值,峰图较杂?
由于测序反应的信号是逐渐减弱的,所以序列末端的信号会很弱,峰图自然就会杂乱,加上测序胶的分辨率问题,如果碱基分不开,就会产生 N 值,正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。

3 、 测序结果怎么找不到我的引物序列?
如果找不到测序所用的引物序列。这是正常的,因为引物本身是不被标记的,所以在测序报告中是找不到的;如果找不到克隆片段中的扩增引物,可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近,开始一段序列很杂,几乎难以辨别,有可能看不清或看不到扩增引物;另外插入片段的插入方向如果是反的,此时需找引物的互补序列。

4 、 测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点?
可能的原因同上,您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近,开始一段序列很杂,几乎难以辨别,有可能看不清或看不到酶切位点。通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物,当然,若是样品出现意外原因,如空载、载体自连等,克隆的酶切位点也是看不到的。

5 、 你测出的结果与我预想的不一致,给我的结果与我需要的序列有差距,这是怎么回事?
首先,我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号,如果对应的是您的样品,由于不知您的实验背景,测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断,我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。

6 、 序列图为什么会有背景噪音(杂带)?是否会影响测序结果?
序列图的背景杂带是由荧光染料引起,如果太强会影响测序结果,要看信噪比,我们给的结果信噪比大都在98%以上。

7 、测序 结果为什么与标准序列有差别?
原因可能有: 样品个体之间的差别、测序准确率的问题,自动测序仪分析序列的准确并非100%,建议至少测一次双向,通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。当然尽管我们有时做了最大努力,但还是保证不了和文献序列完全一致,但我们测序报告是客户样品序列的真实结果。

8 、 PCR 产物测序与克隆后测序序列为什么有差别?
PCR 产物克隆到载体中进行测序,有两个方面可能序列有变化:首先, PCR 扩增过程中可能产生错配。将片段克隆到载体中也有可能发生突变;其次,测序的准确率并非100%。

9 、 有杂合位点,但你们的报告上看不到杂合的信号!
如果在您认为应该出现杂合信号的位置上只出现单一的信号,那么可能是您样品突变的模板与正常的模板的比例没达到可以测出的浓度。测序反应的信号强度直接与模板的量有关,如果突变的模板所占的比例很低,仪器会自动将它作为背景信号了,很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时,才能较可靠地检测到突变体的存在。其次,在同一位置,不同碱基的信号强度一般是不一样的,这样即使突变的模板所占的比例较高时,也不一定能准确检测到突变的存在,因为,测序仪是主要用来测序正常的碱基序列的,软件分析结果时,会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低,以得到尽可能好的结果。尊重结果,我们是不会人为将出现单一的信号修改为杂合位点的。

10 、 DNA 测序样品用 TE 溶液溶解好不好?
由于 EDTA 是 Taq 聚合酶的一种潜在的抑制物, DNA 的测序反应也是 Taq 酶的聚合反应,需要一个最佳的酶反应条件,因此 DNA 测序样品溶解时,最好用灭菌水溶解。

11 、 我送什么形式的菌体样品好?
菌体的一般形态有、菌液,平板培养菌、穿刺培养菌,甘油保存菌等。我们建议客户所送的形态以方便且不易受污染为准则,推荐穿刺培养菌。 上海客户用过夜培养好的菌液2 ml 。

12 、 为什么你们给我的序列是反的?
测出来的结果与您预期的方向并不一致,可能是片断插入方向是非定向的,这在 PCR 产物 T/A 克隆中较常见。有时,客户要求的测序引物离克隆位点较近,如果反向引物相对克隆位点较远,为得到更好的结果,我们会选择反向引物测序,若是这种情况,用看图软件 Chromas 可以把图反转过来,就可得到正向序列。

13 、 Template mixed 为何种情况?
测序结果表现为套峰,测序反应信号很好,测序结果杂乱,即同一个位置有二个峰。
原因可能有:样品并非单一模板、 PCR 产物中有杂带、质粒为双克隆产物、引物特异性不高,有两个结合点, PCR 产物电泳时看不出,但测序结果能清楚地说明这点。

14 、 polyT 或 polyA 后峰图杂,怎么也要收费?
这种情况一般表现为 A 、 T 连续结构后面的测序结果出现套峰,是样品的内在原因。这类问题我们应该同正常测序一样,给客户报告,反应按正常收费。

15 、 我的引物做 PCR 条带很好,但为什么测不出序来?
并不是能做 PCR 反应的引物都能测序,测序所用引物要求较高,必须与模板完全匹配(有时 5' 端可以有个别碱基的简并),引物长度一般为20个碱基左右、 GC 含量适中,而且用于测序的引物一定要足够纯。

16 、如果 我的菌种培养得很好,测序应该不会有问题吧?
对于宿主菌,提倡使用宿主菌 DH5 α, DH1 、 和 C600 E.coli 菌株也可, XL1-Blue E.coli 菌株也不错,但其生长过慢。 JM 系列、 TG1 系列和 HB101 系列 E.coli 菌株等由于产生大量的碳水化合物(即糖),而应当尽量避免使用;其它宿主菌可能会对测序造成影响。

17 、 为什么 G/C rich 的样品没结果或结果不好,照常收费?
由于 G/C 连续结构有时会造成反应中途无法正常进行,如果结构在引物下游近处,反应只有一小段的信号,有时甚至反应根本没信号。对于这种情况,本身就潜在不确定性的测序,有很大的失败因素。

18 、 PCR 产物150 bp 以下的为什么不适于直接测序?
PCR 产物 150bp 以下的纯化和定量都有一定困难,用于测序的 PCR 产物一般不低于150 bp 长度。一个150 bp 的 PCR 产物用于测序,去掉两个引物的序列大约40到50 bp , 再加上测序起始端的一些读不好的碱基,真正能够得到的有用序列不过几十碱基。这只是最理想的假设,这么短片断测序失败的几率非常大,因此只能克隆后再进行测序。

19 、 我的质粒样品很好,测序结果怎不好?
由于原因不明的复杂结构如发卡和回文结构,有时会出现突然信号减弱或消失;有时测序根本不能进行下去, DNA 碱基排列并无特别异常,可能是 DNA 整体出现复杂结构,反应无法进行。

20 、 我的样品还保留了吗?我想现在反向再测一个反应。
出于保密原则我们测序样品只保留一个月,所以若要再测序,请抓紧时间,否则只有重新送样。

21 、 已经测通了样品,但重叠的地方有错配,是为什么?
测通的全序列是拼接后的结果,由于拼接处一般是在一次测序的末端和次个反应开始一段,通常会有一定的杂带,以序列信号好的为主,次的为参考,但也不绝对。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
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