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技术服务
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质粒提取质粒转化 基因组DNA的提取
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蛋白质印迹 客户常问的几个问题
实时荧光定量PCR简介 荧光定量PCR全攻略    引物合成订单下载
基本原理 广泛应用 技术服务  引物设计软件下载

荧光定量PCR检测技术从诞生到现在已经有 8 年了,但是其应用在近四年才迅猛增长。在Medline 数据庫中,用“ Taqman” 或 ”real time PCR”作为关键词检索,在1996年仅有19篇,在1997年仅有28篇,在98 、 99 、2000 年分别达到了52 、157 、409篇, 2003年已经达到2984篇,相信在不久的将来会有更多的文章发表。针对实时 PCR 这一热点领域,闪晶公司对它进行了深入细致的研究,并且及时地为广大科研人员推出这项技术服务。

荧光定量PCR基本原理
•  Taqman 技术:该技术以美国 ABI 公司为代表。 PCR 扩增时,在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸,两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收, PCR 仪检测不到荧光信号; PCR 扩增时(在延伸阶段), Taq 酶的 5' - 3' 外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步,这也是定量的基础所在。



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ABI公司
Taqman探针
MGB探针
Sybr green I染料
ROX染料
Taq酶(荧光定量PCR专用)
热启动酶
热启动荧光PCR定量核心试剂盒
荧光定量PCR一步法RT-PCR试剂盒
TrizolRNA提取试剂
UNG酶
标准品克隆
定点突变
亚克隆
dUTP

•  Beacon 技术:该技术以美国人 Tagyi 为代表。也是加入了荧光探针,但它是 环状的寡核苷酸探针,分别由茎部和环部组成, 两端分别标记 荧光报告基团和荧光猝灭基团,在无靶序列的情况下,探针始终是环状,报告基团的荧光被猝灭基团猝灭,使荧光检测仪检测不到荧光信号;而在有靶序列时,即在 PCR 的退火阶段探针与靶序列结合,使荧光报告基团和猝灭基团分开,这样荧光仪可以检测到荧光,荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。


相关链接......
分子信标知识介绍

•  FRET 技术:该技术以 Roche( 罗氏公司 ) 为代表。它的基本原理是:两条直线型寡核苷酸探针,其中一条的 3 ‘端标记荧光激发基团,另一条的 5 ' 端标记荧光检测基团,在无靶序列的情况下,两条探针分开,无法进行能量的传递,这样荧光仪不能检测到荧光信号;而当有靶序列时,即在 PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合,使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递,这样荧光仪就可以检测到荧光信号,荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。

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Lightcycler University 

实时荧光定量PCR中的几个俗语
•  Ct 值:是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。(如图所示)

•  荧光域值( threshold ):是指 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号,荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍,即: threshold.
•  Ct 值与起始模板的关系:研究表明,每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔 1 〕,起始拷贝数越多, Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代 Ct 值(如图 2 所示)。因此,只要获得未知样品的 Ct 值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光定量PCR应用广泛
•  可以对各种基因的表达进行定量分析,如:同一基因在不同组织中的表达差异、同一基因在不同药物处理后的表达差异、转基因食品的检测。过去最常用的高通量筛选基因表达差异的技术是 cDNA 芯片和差异显示,但这两种技术的缺点是只能定性而非完整意义上的定量分析。实时 PCR 技术和高通道实时 PCR 仪的出现,无疑为这种检测提供了极大的方便。
•  可以进行点突变分析和等位基因分析,用不同的荧光报告基团标记 Taqman 探针,然后分别与野生型和突变型杂交,如果一种荧光信号明显强于另一种荧光信号,则表明它是纯合子;如果两种荧光信号都明显增强,则表明它是杂合子。另外分子信标( Molecular Beacon)就是专门为这种技术设计的探针。
•  可以进行单核苷酸多态性的分析,检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义,因分子信标结构的巧妙性,一旦 SNP 的序列信息是已知的,采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。
•  可以进行 DNA 甲基化检测, DNA 甲基化同人类的许多疾病有关,特别是癌症, Laird 报道了一种称作 Methylight 的技术,在扩增之前先处理 DNA ,使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不受影响,用特异性的引物和 Taqman 探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ,这种方法不仅方便而且灵敏度更高。
•  对传染性疾病进行定量定性分析,这在我国应用比较广泛,大家比较熟悉。许多生产临床PCR 试剂的厂商已经陆续推出了一系列的诊断试剂,如:肝炎系列、性病系列、肿瘤系列等等。

•  闪晶生物同时提供药物伴随诊断(companion diagnostic)方法如EGFR、BRAF V600E突变、HER2 扩增、BCR-Abl、PML-RAR、ALK融合基因、Sry基因检测等。

荧光定量PCR技术服务 (含lncRNA荧光定量PCR-环状RNA荧光定量PCR)
荧光定量PCR用Taqman方法对DNA/RNA进行real time PCR的定量测定或型的鉴定。

荧光定量PCR服务要求
1. 请您提供新鲜的且尽量多的材料(各种材料的RNA提取量请参照“总RNA 的提取”),或直接提供纯化好的总RNA(大于 5 ug/ 样品);(各种材料的DNA提取量请参照“ DNA的提取”),或直接提供纯化好的DNA(大于 5 ug/ 样品)。
2. 请通过E-mail提供已知的全长基因序列。
3. 请提供尽可能详细的背景资料:DNA/ RNA来源、丰度等

荧光定量PCR操作程序
1. 根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。
2. 提取DNA/RNA 。
3. Real Time PCR(荧光定量PCR),进行实验结果分析
4. 实验完成后,提供完整的实验报告(含软件分析结果)及引物等实验材料

荧光定量PCR收费标准
1、RNA提取:10-20个样品的RNA提取是:150元/个;20-30个样品的RNA提取是:120 元/个;30个以上样品的RNA提取是:100元/个;每份材料最少应提供:100mg/样品
2、一个指标每个样品为150元;二个指标每个样品为240元;三指标每个样品为300元,三个指标以上每个样品为80元/反应。
3、引物合成为每个碱基2.1元,探针标记为1200元/条,如果是用sybr green I(染料)做,则免去探针的费用,染料赠送。
4、内参的GAPDH引物探针免费,标准曲线免费赠送。
5、不再收取任何的基础费或者开机费。

(如果样本或者指标数更多,再面议),5000.00元以内的服务费,一律100%预付;乘车路线:火车站坐1号地铁到终点,然后换5号地铁到北桥站即可。
E-mail:quote@synthesisgene.com or shinegene@vip.163.com 免费电话:8009881995

时间:接到样品后1个月内完成!
提供样本:用干冰运输,样品重量在100mg左右;上海的用户可以上门取标本。
技术部免费设计引物探针,客户只需提供标本和genebank的ID号或者告诉我们指标的名称。

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以下是使用闪晶公司荧光定量PCR技术服务发表文章的部分列表

1.刘宁宁,周宁,王炎,刘宣,周利红,吴琼,孙珏,范忠泽,李琦 健脾解毒方通过抑制环氧化酶2下调幽门螺杆菌诱导的人胃癌细胞血管内皮生长因子表达,中西医结合学报: Volume 8   October, 2010   Number 10
2.
蒯筱漪, 李正阳, 张红杰,线粒体解偶联蛋白2在结肠癌中的表达及其临床意义,ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2010728;18(21): 2202-2208
3.
高东,王云月,何霞红,李成云,朱有勇,,TaqMan 荧光定量RT-PCR检测水稻RAcl基因mRNA方法的建立,云南植物研究所  2009 311:75~81
4.
赵杨, 韩凤珍, 刘益芬, 陈敦金,正常妊娠和子痫前期胎盘Syncytin 表达差异探讨,中山大学学报(医学科学版)》> 20094302
5.
岳志芹 刘荭  梁成珠 高宏伟  徐彪 邓明俊 江育林,实时定量RT-PCR检测鱼类传染性造血器官坏死病毒方法的建立与应用,水生生物报 20081月第32卷第1
6.
, 任雪峰, 刘臣海, 伟,MUC5AC特异性siRNA对胆管癌细胞株HCCC-9810增殖及凋亡的影响,世界华人消化杂志 2009228;17(6): 566-572
7.
陈津津,蔡威实时荧光定量PCR方法检测幼兔粪便双歧杆菌的实验研究,世界华人消化杂志  20065181414):1367-1371
8.
凌扬,刘永萍,王凤君,孔颖泽,张亚平,胃癌患者外周血癌胚抗原mRNA表达及其临床意义分析,中国肿瘤临床     2008年第35卷第16
9.
熊欣,郑长黎MiRNA-214对胃癌细胞BGC823MKN45的细胞周期与凋亡的影响, 中国普通外科杂志  19卷第12
10.
毛丽萍 ,金小云 “,王跃国 ,王惠民转录因子EBF3在肝癌组织中的表达及意义,临床检验杂志2008年第262
11.
刘雪云,刘永,李金凤,岳少杰,申丽,李晨,汉建忠,许建平,冯丹丹,刘惠君,罗自强,中性粒细胞mGluRI的激活促进其与内皮细胞相互黏附,生理学报Acta Physiologica sinica,June25,2010,62(3):219-224
12.
, 强,FHIT基因转染对胆管癌细胞增殖与侵袭的影响世界华人消化杂志 20091128;17(33): 3437-3440
13.
林琳,张桦,张慧涛,贾宁,汪悠悠,朱晔,周文英,彭晓,整合素连接激酶在肾小管上皮细胞转分化中的作用中华临床医师杂志(电子版) 20097,37
14.Xiao-Yi Kuai, Zheng-Yang Li, Hong-Jie Zhang
Clinical significance of mitochondrial uncoupling protein 2 expression in colon cancer, 世界华人消化杂志 2010728;18(21): 2202-2208
15.
高 东  何霞红 王云月 李成云 朱有勇,水稻GA20ox-2基因mRNA的TaqMan荧光定量RT-PCR检测,中国水稻科学(ChinJRiceSci),2009,23(3):309~3
16.
高宏伟,梁成珠,岳志芹,吴华,使用Eva Green染料的荧光PCR定性检测转基因产品,(自然科学版)200637(2)319324
17.XIONG Xin ZHENG Changli,The effect of miRNA-214 on cell cycle and apopeosis of gastric cancer cell Lines BGC823 and MKN45, Chinese Journal of General surgery.2010.19(12):1311-1315
更多有关闪晶公司的相关文献可以访问如下网页:
http://scholar.google.com/scholar?hl=en&q=shinegene+real+time+pcr&as_sdt=0%2C5&as_ylo=&as_vis=0

部分客户对闪晶公司的服务评价
1.我是一名临床医生,对实验一点经验都没有,后来有同事介绍闪晶公司,我只要提供细胞给他们就可以了,最后闪晶公司提供完整的实验报告和实验数据给我,非常的简单.
------------------------------------------------北京协和医院曹博士
2.我是一名刚进实验室的研究生,对引物探针的设计一点概念都没有,闪晶公司免费提供技术咨询,我只要将gene ID告诉闪晶就可以了,闪晶公司帮设计引物探针和合成,质量很好.
------------------------------------------------上海新华医院杜医生
3.我有42个大鼠肝脏组织样品,检测4个基因,闪晶公司15个工作日就将实验报告和数据整理好发给我了,速度很快,很好,我会介绍我的同学或朋友过去的.
------------------------------------------------上海瑞金医院杨博士
4.我在闪晶做了50个水稻组织的荧光定量PCR,结果很好,抽提出来的RNA条带很清晰.
-------------------------------------------------浙江大学吴博士


MicroRNA(miRNA)荧光定量PCR技术服务

一、什么是miRNA?
MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成,不同于siRNA(双链)但是和siRNA密切相关。据推测,这些非编码小分子RNA(miRNAs)参与调控基因表达,但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4 和let-7,随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRN As

二、miRNA是如何产生的?

ri图一: MicroRNA的产生

miRNAs 是转录后长片段的 RNA 分子( pri-miRNA )的一部分,首先在细胞核内被双链RNA特异的核酸酶Drosha 处理成为 70-100 个核苷酸组成的发夹结构 RNA ( pre-miRNA )。这一发夹结构 RNA 运输到细胞质,被另一个双链 RNA 特异的核酸酶 Dicer 剪切,得到 19-23 个 核苷酸组成的成熟的 miRNA ,结合在与 RNA 介导的沉默复合物( RISC )类似或者相同的复合物中,这个复合物参与了 RNA 干扰。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的碱基配对引导 RISC 降解目的片段或是阻碍其翻译过程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互补的碱基配对决定了这个过程的特异性。通过抑制翻译还是降解发挥作用是由 miRNA 和它的目的mRNA之间的错配程度决定的,匹配程度高的目的mRNA将被降解。由于miRNAs可以对不完全互补的 mRNA 配对来抑制蛋白质的翻译过程,因而每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNAs可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来经济地调控多个基因的表达,也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。对于基于miRNA 调控基因表达的研究的逐步深入,将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。

三、miRNA荧光定量PCR基本原理
实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光试剂,利用荧光信号实时检测PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。但是就成熟的microRNA而言,由于其是由21-25个核苷酸组成的小RNA,长度太短,并不能通过传统的实时定量PCR进行检测,但是通过特殊设计的茎环结构的反转录引物,配合实时定量PCR引物及探针可以精确检测微量样品中microRNA表达水平,也可以用终点PCR法定性检测。

图一 miRNA 实时荧光定量PCR原理

虽然 microRNA 实时定量PCR是一种最近才发展起来的检测技术,其技术细节还在不断完善中,但是microRNA 实时定量PCR检测系统,相对其它microRNA检测技术有以下优点:
1.高特异性 , 可以只对成熟 microRNA 进行定量,有效区分成熟 microRNA 分子和前体分子以及其它成熟 microRNA 的同源分子;
2.快速,简单,省时,整个操作只需两步,不到 3 个小时,即可获得高质量的数据;
3.检测灵敏度高,样品消耗少,仅需 1-10ng 的总 RNA 或 50pg 左右的 microRNA ;
4.超宽的线性范围,可跨越 7 个数量级;


图二 人的脑( B ),心脏( H )和肝脏( R )组织中 microRNA 表达情况:分别采用实时定量 PCR ,终点法 PCR 和 Northern Blot 检测, RNA 用量和时间见图。

四、miRNA序列在线查找

http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/  

参考文献
1.Livak KJ, Schmittgen TD: Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.Methods 2001, 25:402-408.
2.L D Ke, Z Chen .A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards Mol Cell Probes. 2000 Apr;14(2):127-35.
3.Weihong Liu and David A. Saint Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics Biochemical and Biophysical Research Communications 294 (2002) 347–353
4.Caifu Chen, Dana A. Ridzon, Adam J.Real-time quantification of microRNAs by stem–loop RT–PCR.Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 20

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